Etap 2:
Izolacja i namnażanie bakteriofagów
Wprowadzenie
Drugi etap projektu realizowano od 18 stycznia 2024 do 22 kwietnia 2024 roku. Jego głównym celem było wyizolowanie bakteriofagów aktywnie degradujących serowary bakterii Salmonella oraz ich namnażanie na skalę preparatywną. Etap ten obejmował kilka kluczowych działań, takich jak przygotowanie prób środowiskowych, izolacja fagów, ich oczyszczanie oraz przygotowanie banku ultraczystych lizatów bakteriofagowych.
Przygotowanie prób środowiskowych
Przed izolacją bakteriofagów przygotowano próbki środowiskowe, które wcześniej pobrano z różnych źródeł, takich jak ścieki komunalne, gleba, odchody ptaków i woda. Materiały te przeszły proces oczyszczania, zagęszczania oraz homogenizacji. W próbkach gleby i odchodów drobiu zastosowano mieszanie z odpowiednimi podłożami mikrobiologicznymi, co umożliwiło stworzenie odpowiednich warunków do hodowli bakterii i fagów.
Proces izolacji bakteriofagów
Bakteriofagi zostały wyizolowane za pomocą mikrobiologicznych metod hodowlanych, polegających na kultywacji próbek środowiskowych w obecności wybranych szczepów bakterii Salmonella. Proces izolacji obejmował inkubację próbek w temperaturze 37°C z odpowiednimi szczepami bakterii. Po tym czasie próbki były wirowane, a zawiesiny rozcieńczano i nanoszono na podłoża selekcyjne z zastosowaniem metody agaru dwuwarstwowego. Przejaśnienia w murawie bakteryjnej (łysinki fagowe) świadczyły o obecności aktywnych bakteriofagów.
Namnażanie bakteriofagów
Po wyizolowaniu bakteriofagów przystąpiono do ich namnażania na skalę preparatywną. Każdy bakteriofag został namnożony w objętości 6 litrów, a następnie zagęszczony za pomocą glikolu polietylenowego (PEG 8000). Proces zagęszczania odbywał się przez noc w temperaturze 4°C na mieszadle magnetycznym. Po zakończeniu inkubacji przeprowadzono wirowanie próbek w celu oddzielenia cząsteczek wirionów od pozostałości bakterii.
Oczyszczanie lizatów bakteriofagowych
Oczyszczanie bakteriofagów przeprowadzono za pomocą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu. Proces ten pozwolił na uzyskanie ultraczystych preparatów fagowych, pozbawionych zanieczyszczeń w postaci materiału genetycznego bakterii i ich białek. Po wirowaniu prążki odpowiadające fagom zbierano za pomocą strzykawek i umieszczano w workach dializacyjnych, gdzie były dializowane wobec buforu TM przez osiem dni w celu usunięcia resztek chlorku cezu.
Przygotowanie banku ultraczystych lizatów bakteriofagowych
Na zakończenie drugiego etapu stworzono bank ultraczystych lizatów fagowych. Każdy z lizatów został odpowiednio oznaczony etykietą informacyjną, zawierającą dane o numerze bakteriofaga, szczepie gospodarza oraz metodzie przechowywania. Lizaty były przechowywane zarówno w temperaturze +4°C, jak i w formie konserw z glicerolem w -80°C.
Podsumowanie
Udało się skutecznie wyizolować bakteriofagi z różnych próbek środowiskowych i przeprowadzić ich namnażanie oraz oczyszczanie. Bank ultraczystych lizatów fagowych będzie stanowił podstawę do dalszych badań w kolejnych etapach projektu, w szczególności dotyczących spektrum działania fagów wobec różnych serowarów bakterii Salmonella.
Wszystkie zebrane lizaty były stabilne zarówno w temperaturze pokojowej, jak i w chłodniach, co ma istotne znaczenie dla przyszłych badań i zastosowań bakteriofagów w przemyśle drobiarskim.